Хибридизация in situ

Най- хибридизация in situ е метод за откриване на хромозомни аберации. Определени хромозоми са маркирани с флуоресцентни багрила и са свързани с ДНК сонда. Тази техника се използва за пренатална диагностика на генни мутации.

Какво е хибридизация in situ?

В случай на in situ хибридизация или Флуоресценция in situ хибридизация нуклеиновите киселини от РНК или ДНК се откриват в определени тъкани или клетка, използвайки молекулярно генетични методи. Обикновено този тип диагноза се използва за откриване на структурна или числова хромозомна аномалия по време на бременност.

За тази цел се използва изкуствено произведена сонда, която сама по себе си се състои от нуклеинова киселина. След това се свързва с нуклеиновите киселини в организма чрез сдвояване на основата. Тази връзка се разбира под термина хибридизация. Доказателствата се основават на живата структура на пациента и следователно съответстват на in-situ доказателства. Това трябва да се разграничи от in vitro методи, при които откриването се извършва в епруветката. Методът е разработен през 20 век от учени Джо Гол и Мери Лу Парду.

Технологиите се развиват оттогава. Докато радиоактивни сонди са били използвани по това време, например, днес се използват белязани с флуоресценция сонди с ковалентна връзка към молекулите на маркера.

Функция, ефект и цели

In-situ хибридизация обикновено се използва за откриване на хромозомни аберации, т.е. хромозомни аномалии, които не могат да бъдат открити в кариограма. Това означава, че методът винаги се използва, когато наследствените заболявания трябва да се определят по време на бременност.

Тъй като хромозомните аберации са проблем, който днес не бива да се подценява, използването на метода с времето се увеличава. Хибридизацията се извършва на базата на местни клетки от околоплодната течност на майката. Основата на технологията е свързването на маркираната с цвят сонда към ДНК части. Благодарение на свързването, броят на копията може по-късно да бъде оценен с микроскоп, тъй като отделните копия излъчват светлинен сигнал и по този начин могат да бъдат видими под микроскопа. Има различни процедури. Или анализът се извършва веднага след свързването.

В този случай се използва флуоресцентно багрило като биотин, което се свързва директно с ДНК сондата. С индиректния метод на in situ хибридизация, оценката не може да се извърши веднага след хибридизацията, тъй като флуоресцентните вещества могат да се свързват към сондата само след хибридизация. Този косвен метод се използва по-често от директния, тъй като се смята, че е по-чувствителен. В допълнение към специфичните за хромозомата центрометрови ДНК сонди има също така специфични за локуса ДНК сонди, специфични за хромозомата ДНК библиотеки и сравнителни хибридизации на геном.

Хромозомно-специфичните центрометрови ДНК сонди могат да бъдат използвани за откриване на хромозомно числови аномалии. Това означава, че те се използват главно, когато има съмнение за дублирани или изтрити хромозоми. Специфичните за местоположението ДНК сонди са особено подходящи за откриване на минимални мутации, които не могат да бъдат открити в кариограмата. Специфично за хромозомата ДНК библиотека се използва по-специално за откриване на вмъквания и транслокации.

Сравнителната хибридизация на генома, от друга страна, е цялостен анализ на загубите и печалбите от хромозомния материал. Днес хибридизацията на място е много важна при диагностицирането на различни хромозомни мутации.При диагностицирането на синдрома на Даун, пробите се свързват например с хромозома 21. За тази цел обикновено се използват специфични за хромозомата сонди, които могат да се използват, ако се подозира това заболяване.

Подозрение може да възникне например, ако родителите преди това са родили дете със заболяването и ехографският образ е ненормален. Ако има двойна връзка вместо двойна връзка и по този начин се извежда троен цветен сигнал, диагнозата се счита за потвърдена.

Рискове, странични ефекти и опасности

За разлика от, например, PCR, in-situ хибридизацията е значително по-малко податлива на замърсяване. Освен това времето, необходимо за процеса, е изключително малко. Въпреки това, тъй като по-специално ембрионите образуват хромозомни модели, модел не може да се използва, за да се определи със сигурност останалата част от хромозомното разпределение и по този начин генетичния статус на други клетки.

Цветните сигнали също могат да се припокриват или да останат невидими по други причини. В резултат хибридизацията на място като диагностичен инструмент е относително предразположена към грешки по време на бременност. Погрешни диагнози могат да възникнат и родителите могат да решат срещу здрав ембрион. За да се намали чувствителността към грешки на хибридизацията in situ, трябва да бъдат изследвани най-малко две ембрионални клетки едновременно. Чрез изследване на две клетки паралелно, сега съществува само пренебрежимо малък риск от неправилна диагноза.

В такъв случай родителите могат абсолютно да разчитат на диагнозата. Хибридизацията на място не се предлага на всяка бременна жена, а само на жени от рискова група. Независимо от това, бременните жени не са отказани от този вид диагноза по свое желание. Ненормални ехографски находки или ненормален серум могат да накарат лекар да предложи диагностичната процедура. Макар и голяма част, но в никакъв случай не всички, хромозомните аберации могат да бъдат диагностицирани с помощта на in situ хибридизация.

Следователно in-situ хибридизацията никога не трябва да се провежда самостоятелно, а винаги трябва да се използва заедно с конвенционален хромозомен тест. Грижата за бременната жена играе основна роля в тази процедура. Преди анализа се провежда задълбочена дискусия с бъдещата майка относно диагностичния метод, който обяснява рисковете, възможностите и границите на технологията.